日本千叶大学医学院医学免疫学系，日本千叶大学医学院耳鼻喉科头颈外科
不变自然杀伤T(iNKT)细胞通过识别由CD1d提呈的α-半乳糖基神经酰胺(a-GalCer)等，在T细胞受体(TCR)刺激下产生大量的细胞因子。因此，组织其他免疫细胞来对抗病原体感染和肿瘤。因为它们具有较强的抗肿瘤反应能力和由合成配体a-GalCer激活永久TCR的能力，iNKT细胞在临床上被广泛应用于免疫治疗方法中。在这里，我们总结一下。iNKT细胞免疫治疗非小细胞肺癌和头颈癌的临床试验。虽然实体肿瘤被认为是免疫治疗的难治性，但我们的临床l试验显示，静脉注射α-GalCer负载抗原提呈细胞(APCs)可激活内源性iNKT细胞和iNKT细胞依赖性反应。此外，数量的增加PBMCs中产生 IFN-γ的细胞与长期存活有关。在注射α-GalCer负载的APC和/或体外激活的iNKT细胞后，肿瘤微环境中标记的iNKT细胞浸润和常规T细胞的聚集也被发现。在晚期头颈部鳞状细胞癌中，iNKT细胞在肿瘤微环境中的数量增加和积累与客观的临床反应密切相关。我们还将讨论以iNKT细胞为基础的免疫治疗的潜在联合疗法，以达到增强抗肿瘤活性的目的，并为这些患者提供更好的治疗方案。
不变自然杀伤T(iNKT)细胞占小鼠脾脏的1%-2%，在人外周组织中仅占0.1%(1)。虽然iNKT细胞数量较少，但它能引起强烈的免疫应答。产生大量的细胞因子，导致其他免疫细胞的反应，并诱导细胞毒性，因此，它们在天然免疫和适应性免疫中都具有重要作用。
传统T细胞在TCR重排后表达不同的T细胞受体(TCR)，并识别MHC上的同源肽，iNKT细胞表达人体Va24-Ja 18链和Vb 11链组成的单克隆TCRs。Va14-Ja18链和Vb8.2链存在于鼠体内，识别由CD1d提呈的糖蛋白抗原，CD1d是MHCⅠ类分子(2，3)。另一个独特的特征iNKT细胞与传统T细胞的区别在于iNKT细胞表达NK细胞受体，包括CD 56、CD 16、NKG2D和CD 161(4)。因此，iNKT细胞像NK细胞一样可进行非TCR依赖性抗原识别。1997年，Kawano等人从海绵体中提取的α-半乳糖基神经酰胺(a-GalCer)被鉴定为激活iNKT细胞的糖脂配体。这一发现增强了我们对iNKT细胞在过去免疫中的作用和作用的理解(5)。在多种疾病，如癌症和自身免疫性疾病方面，A-GalCer是一种潜在的控制免疫应答的治疗工具。
在肿瘤免疫中，iNKT细胞的作用最初是通过小鼠模型来证明的。与野生型小鼠相比，CD1d基因敲除小鼠或Va14敲除小鼠缺乏iNKT细胞较易发生肿瘤。提示iNKT细胞在抗肿瘤免疫中起着至关重要的作用.因为iNKT细胞识别在抗原提呈细胞(APC)上表达的CD1d上的a-GalCer，在小鼠肝转移和肺转移模型(6)中，α-GalCer负载的树突状细胞(DC)能扩增NKT细胞并抗肿瘤。此外，甚至a-GalCer负载的DC对转移性肿瘤也产生杀伤作用。TCR通过识别由CD1d提呈的a-Galce刺激iNKT细胞产生大量的细胞因子，包括IFN-r和IL-4。这些事件导致体内NK细胞和CD8+T细胞的活化，未成熟的DC转化为成熟的DC，从而增强其他免疫细胞间接抗肿瘤反应。iNKT细胞也产生颗粒酶A和颗粒酶B，表达Fas配体和TRAIL，发挥直接杀伤肿瘤的作用(8)。iNKT细胞的这些多向性功能被认为与肿瘤根除有关。基于这些发现，我们应用a-GalCer负载的DC作为iNKT细胞免疫治疗癌症患者的工具。
iNKT细胞免疫治疗肺癌
肺癌是全世界癌症死亡的主要原因。非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的肺癌类型，可分为鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌三种典型亚型之一。虽然细胞毒性化疗药物已被用作治疗晚期或不可切除的非小细胞肺癌的一线药物，但对许多患者来说，这是一种新的治疗方法。近年来，一些PD-1信号阻断抗体已被临床认可，并被用作一线或二线治疗(17)。这些治疗已经有了令人印象深刻的结果，但不是全部的非小细胞肺癌患者，因此，替代疗法仍然被高度渴望来改善非小细胞肺癌患者的预后。
建立a-GalCer负载APCs
免疫治疗被广泛认为是一种强有力的癌症治疗工具，因为免疫检查点阻断了程序性死亡-1(pd-1)抗体，在某些肺癌患者中可以显著根除肿瘤(9)。自那时以来，各种免疫治疗方法已经被研究，为癌症患者确定更好的治疗方案。其中一种方法是基于iNKT细胞的治疗，针对肺癌和头颈癌患者的iNKT细胞靶向免疫治疗的临床试验已经在千叶大学进行。在此，我们将回顾我们对iNKT细胞的临床试验(表1)。我们还将讨论iNKT细胞免疫治疗的下一步，包括联合治疗和诱导多能干细胞(IPS)细胞衍生的iNKT细胞。
早期临床试验：a-GalCer负载APC的应用
一般而言，DC是在DC诱导的细胞因子GM-CSF和IL-4存在下，从外周血CD 14阳性单核细胞中产生的。利用这些细胞来靶向细胞毒性T淋巴细胞的一些临床研究已经完成。然而，这种培养方法可能不适合于iNKT细胞的临床试验，因为需要大量的DC来对抗和激活患者周围少量的iNKT细胞。因此，我们开发了一种从外周血单个核细胞(PBMCs)中获取大量APC的新方法。除了DC细胞，其他免疫细胞如活化的T细胞，在其细胞表面表达CD1d，因此建议用培养的整个PBMCs代替DC(20)。据报道，PBMCs在GM-CSF和IL-2存在下培养，由CD1d呈递α-GalCer，在诱导人iNKT细胞的增殖和活化方面优于在GM-CSF和IL-4存在下产生的DC。
早期临床试验：a-GalCer负载APC的应用
由于与单核细胞来源的DC相比，在gm-csf和IL-2存在的条件下PBMCs产生的大量apc能更有效地提呈a-galcer和激活iNKT细胞。我们为NSCLC患者设计了使用a-GalCer负载APCs(10)的Ⅰ期临床试验。11例Ⅳ期或复发性非小细胞肺癌患者参加了本研究，9例完成了治疗。在第一阶段的研究中，我们研究了三种不同剂量的α-GalCer负载APC的安全性，分别是以1级：5×107、2级：2.5×108和3级：1×109细胞/m2。患者接受四次静脉滴注α-GalCer负载APC在3个月内注射。虽然所有病例都未能观察到客观的临床反应，但接受3个剂量的a-GalCer负载APCs的患者显示出iNKT细胞在周围扩增，并可长期存活一年以上。这些iNKT细胞均有较高的IFN-r mRNA表达。所有病例均未观察到超过二级的严重不良事件，包括最高剂量为3级，提示α-GalCer负载APC是安全可行的治疗方法。此外，3级剂量(1×109个/m2)被认为是最有效的α-GalCer负载APC治疗晚期非小细胞肺癌的剂量。
然后我们设计了下一步，NSCLC患者Ⅰ-Ⅱ期临床试验，以扩大iNKT细胞免疫治疗的研究范围。2月至8月，23名患者参加了这项研究，17人完成了治疗。患者为IIIB期、IV期或复发性NSCLC患者，均接受标准治疗。在此过程中α-GalCer负载APC的安全性和1×109细胞剂量的免疫反应被检测。所有患者均接受2个疗程，4次注射1×109a-GalCer负载APCs.关于不良事件，一名病人深静脉血栓复发(DVT)(估计为三级不良事件)，并需要住院继续注射肝素。千叶大学细胞治疗质量保证委员会没有明确确定细胞治疗与DVT之间的关系。由于在其他病人身上没有观察到严重的副作用，A-GalCer的安全性被证实了。在免疫监测方面，10例患者在接受α-GalCer负载APCs治疗后，外周产生的IFN-r细胞增加了两倍以上(反应较好)。7例患者IFN-r生成轻度或无增加(反应不良)。此外，患者外周产生IFN-r的细胞增多与中位生存期(MST)有关，良好反应者的MST(29.3个月)比不良反应者(9.7个月)长。总的来说，所有病例的MST为18.6个月。因为这个临床试验不是一项随机对照研究，我们不能得出a-GalCer负载APC的优越性；然而，这些数据鼓励我们进行一项比较研究，即比较a-GalCer负载APC和标准的细胞毒性药物。
为了进一步阐明在非小细胞肺癌患者的肿瘤微环境中，应用α-GalCer负载APCs触发iNKT细胞免疫应答的机制，我们进行了一次临床实验。针对4例经手术治疗的ⅡB期和IIIA期非小细胞肺癌患者，对照组6例。患者手术前七天单次静脉注射1×109α-GalCer负载APCs。之后从手术切除的肿瘤组织标本中分析特异性肿瘤免疫细胞浸润情况。与正常肺单个核细胞和引流淋巴结比较浸润淋巴细胞相比，在肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中iNKT细胞比例较高。与对照组相比α-GalCer负载APC处理组iNKT细胞在TIL中的比例增加。此外，α-GalCer负载APC处理组，我们观察到α-GalCer负载APC给药后，TIL中产生IFN-r的细胞数量增加，表明系统注射α-GalCer负载APC通过产生IFN-r诱导局部iNKT细胞在肿瘤微环境中聚集，诱导免疫应答。
第一期临床试验：iNKT细胞的应用
为增加外周血iNKT细胞数量，对6例复发性肺癌患者进行体外扩增NKT细胞的I期临床试验。iNKT细胞在α-GalCer和IL-2存在的条件下以PBMC为材料进行培养，体外扩增iNKT细胞(1级：1×107细胞/每次注射，2级：5×107细胞/每次注射)通过静脉注射给病人。以前有报道说，在癌症患者中，iNKT细胞的频率较低，增殖能力受损，而在本次研究中iNKT细胞来源于患者，扩增并产生Th1型优势细胞因子，包括IFN-r，以及体内外的杀瘤活性。在这项研究中，没有病人有严重的不良反应。接受了2级剂量的三名病人中有两名显示IFN-r生成增加，但无一例患者达到客观临床反应的标准。这些结果表明，使用α-GalCer负载的APC与体外扩增的iNKT细胞相比，是一种更有效的方法，治疗效果更好。
经第一线治疗的晚期或复发性非小细胞肺癌患者静脉注射α-GalCer负载APCs，被日本卫生部“劳动与福利组织”接受为一种先进的药物。从那时起，35名患者参加了这项研究，32名接受了所有疗程的治疗。随访工作于完成，目前我们正在对临床效果和免疫反应进行分析。
iNKT细胞免疫治疗头颈部肿瘤
头颈部癌(HNC)约占所有癌症的5%。尽管对晚期患者进行了包括手术、放疗和化疗在内的多学科治疗，但复发死亡率仍然很高，因此，存活率仍然相对较低。此外，接受这些综合治疗的患者的生活质量(QOL)往往受到严重损害。改善头颈部肿瘤患者的预后和生存质量，开发新的治疗方法是非常必要的。因为iNKT细胞对非小细胞肺癌的实体瘤患者患者的免疫治疗显示了良好的治疗效果。我们设计了基于iNKT细胞的HNC患者免疫治疗的临床研究。在非小细胞癌患者静脉注射α-GalCer负载APC时，我们发现鼻黏膜下注射可导致APCs迁移到颈部淋巴结区。此外，鼻黏膜下注射α-GalCer负载APCs可增加患者周围组织中iNKT细胞和产生IFN-r的细胞数量增加。相反，在口腔底粘膜下层注射α-GalCer负载APCs可诱导免疫耐受，表现为CD45RA−Foxp3阳性的Tregs的数量增加代替了抗肿瘤活性。这些结果表明，经鼻黏膜下给药的α-GalCerPulseAPCs是头颈部癌患者的较好选择。我们还证实iNKT细胞的数量和功能不受放射治疗的影响，提示iNKT细胞免疫治疗可能作为一种辅助治疗晚期HNC放疗患者。
iNKT细胞免疫治疗晚期和复发性HNC的临床试验
我们用α-GalCer负载APCs对复发或无法切除的HNC患者进行了iNKT细胞免疫治疗的一期临床试验研究。9名患者参加了这项研究，通过鼻黏膜下注射α-GalCer负载细胞(1×108个细胞/注射)。在本研究期间，未观察到3级以上的严重不良事件。此外，4例患者外周血iNKT细胞增多，8例患者IFN-r生成细胞增多。这些结果表明，α-GalCer负载APC应用于鼻粘膜下层是诱导iNKT细胞抗肿瘤反应的一种安全有效的途径.然而，本研究的临床疗效并不理想。为了提高临床疗效以及证实以iNKT细胞为基础的免疫治疗在复发或无法切除的HNC患者中的安全性，我们采用体外扩增的iNKT细胞和α-GalCer负载APCs联合治疗。我们对8例复发性难治性HNC患者进行了Ⅰ期临床研究。因为大多数头颈部癌症患者通过末梢动脉接受血液供应，动脉内输注抗癌药物是目前常用的方法。患者接受两次鼻粘膜下注射α-GalCer负载APCs(1×108细胞/注射)和1次动脉内注射激活的iNKT细胞(5×107细胞/注射)。除1例部分缓解患者(PR)出现合并咽皮瘘(Ⅲ级)外，其他患者无严重不良事件发生。3例患者表现为PR（部分缓解）。4例患者表现为稳定期(SD)或疾病进展(PD)。所有患者治疗后外周血iNKT细胞数增加3倍以上，7例患者外周血IFN-r产生细胞数增加4倍。Ⅱ期临床试验中，10例局部复发的HNC患者接受抢救手术。因此，体内外经末端动脉注射iNKT细胞(5×107细胞)，联合在鼻黏膜下注射α-GalCer负载APCs(1×108细胞)。所有患者未观察到2级以上严重不良反应。9例患者外周血iNKT细胞增多，此外，所有患者外周血IFN-r生成细胞均增加。另外，5例患者达到PR，5例患者达到SD。有趣的是，PR组iNKT细胞浸润率高于SD组。基于这些结果，我们认为，联合应用体外扩增的iNKT细胞和α-GalCer负载APC，协同增强了抗肿瘤免疫反应和临床疗效。
HNC患者正在进行的先进医学研究
一项双盲随机研究对于为发展癌症新疗法提供令人信服的证据至关重要；因此，我们对a-galcer负载APC或非负载APC进行了一项双盲随机研究。对HNC患者经鼻黏膜下层给予a-galcer负载APC或非负载APC标准治疗后，患者表现为完全缓解(CR)。这项研究的目的是阐明iNKT细胞在预防HNC中的作用。这项研究的目的是阐明iNKT细胞在防治有轻微残留病灶的复发性HNC治疗中的作用。这项研究被日本卫生、劳动和福利部接受为先进的医疗服务。招募被诊断为Ⅳ期的HNC并经标准治疗后达到CR的患者，探讨HNC复发的预防措施。患者接受了两次a-GalCer负载APC治疗(1 × 108cells/一次注射)，分别在第7天和第10天进行鼻黏膜下层注射。病人招募、随访和免疫学分析正在进行中。
根据上述临床试验的结果，iNKT细胞免疫疗法被认为是治疗肺癌和头颈癌的一种很有前途的治疗方法。一些可以提高治疗的因素可以得到改善，为患者提供更好的治疗方案。由于iNKT细胞是如此之小的淋巴细胞群，因此如何有效地增加iNKT细胞的数量，增强其功能，包括IFN-r的产生和杀瘤活性至关重要.我们目前正在研究两种方法，使我们目前的iNKT细胞免疫治疗更有效，一种是iPS细胞衍生的NKT细胞(iPS-NKT细胞)，另一种是联合治疗。ips细胞是通过引入基因表达四种转录因子(Oct 4、sox 2、klf 4和c-myc)而产生的，称为Yamanaka因子。它们被重新编程成胚胎干细胞样细胞，可以自我更新并分化为多种细胞类型。Yamada et al.通过引入Yamanaka因子，从外周血单个核细胞或脐血单个核细胞中分离出iNKT细胞，成功地生成人iPS-NKT细胞(26)。iPS-NKT细胞具有iPS细胞表型，并保留NKT细胞的功能，如细胞因子的产生和细胞毒活性。iPS-NKT细胞的产生将有助于为低iNKT细胞数量的患者提供足够数量的iNKT细胞用于下一次iNKT细胞的免疫治疗。我们目前正在对iPS-NKT细胞进行非临床试验，对它们的安全性和有效性进行评估。此外，我们还在研究潜在的联合疗法，以增强iNKT细胞的免疫治疗。我们发现PD-1/PD-L1的抑制剂，一种免疫检查点抑制途径，它可以增强了iNKT细胞的功能，包括细胞因子的产生和杀伤肿瘤的活性，提示免疫检查点抑制剂和iNKT细胞的联合免疫治疗可能具有协同作用，并发挥强大的抗肿瘤免疫。
这项工作得到日本医学研究和发展机构(编号：18m0304003h0106至SM)的支持。
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