如何用逆向思维研究癌症调控机制

长链非编码(long non-coding RNAs ，lncRNAs)现如今在癌症的发生发展中是一个研究热点，最常见的作用方式是通过海绵结合miRNAs发挥作用。在大多数的研究中，通常是已知研究lncRNAs，通过生物信息学筛选、二代测序等方式，寻找能够海绵结合的miRNAs；而今天解读的这篇文献，是通过已知研究的miRNAs，寻找能够海绵结合的lncRNAs。

筛选和鉴定与肝癌耐药相关的候选miRNA

该研究采用TRAIL非耐药肝癌细胞株HepG2S和Bel-7402S，以及TRAIL耐药肝癌细胞株HepG2R 和Bel-7402R进行研究。首先使用MTT试验验证了耐药细胞株的HepG2R 和Bel-7402R耐药性（图1A）。

紧接着，由于TRAIL诱导的细胞凋亡是以caspase依赖的方式进行的，因此，在上述四株细胞株中，检测了CASP8和CASP3的mRNA和蛋白的表达情况，结果表明两者的表达量在耐药细胞株中均下调（图1B-C）。

为了研究其中的耐药机制，该研究使用在线工具(Targetscan，RNA22,miRWalk和Starbase)搜索可能调控caspase 3或caspase8的候选miRNA。结合GEO数据库，选择耐药肿瘤细胞中的非下调miRNA (图1D)。在筛选出的这些miRNA中，通过构建mimic过表达模型发现，对caspase8下调力度最强的是miR-24-3p，对caspase 3下调力度最强的是miR-221（图1E-F）。

MiR-24/miR-221促进肝癌细胞对TRAIL的抗性

选取上述研究中选取的miR-24和miR-221，通过构建过表达和敲降的细胞模型，采取Q-PCR、流式细胞术等实验，证明miR-24和miR-221促进肝癌细胞对TRAIL的抗性（图2）。

MiR-24/miR-221通过直接靶向负性调控caspase8/3

为了进一步确证miR-24/miR-221对caspase 8/3的调控作用，本部分研究采用了荧光素酶报告基因试验、和Western blot实验，证明了miR-24/miR-221通过直接靶向负性调控caspase 8/3（图3）。

抑制CASC2能促进TRAIL抗性

前期的研究报道证明，在肝癌中CASC2能抑制肝癌的增殖。因此，该研究在耐药细胞株HepG2R 和Bel-7402R中敲降CASC2，使用MTT实验和流式细胞术，证明敲降CASC2能够抑制细胞的TRAIL抗性（图4）。

CASC2通过直接靶向对miR-24和miR-221进行负调控

通过miRCode预测显示，CASC2与 miR-24/miR-221有直接作用的位点，因此，该研究设计了荧光素酶报告基因试验和RIP实验验证，并且敲降CASC2后miR-24和miR-221的表达量显著提高，证明了CASC2通过直接靶向对miR-24和miR-221进行负调控（图5）。

CASC2通过miR-24/miR-221调节TRAIL抗性

该部分实验通过在耐药细胞株HepG2R 和Bel-7402R中敲降CASC2和/或miR-24/miR-221进行营救实验，使用MTT试验和流式细胞术，证明了CASC2通过miR-24/miR-221调节TRAIL抗性，并且通过Western blot实验验证了CASC2/ miR-24/miR-221对caspase 8/3的调控作用（图6）。

总结

该研究是一项比较经典的lncRNA/miRNA/蛋白对于癌症的调控作用的研究，不过该研究的出发点是蛋白（caspase 8/3），随后找到调控蛋白的miRNA（miR-24/miR-221），最后找到调控miRNA的lncRNA（CASC2），完成了这一调控路径。这种逆向的研究思路，或许值得大家借鉴一下。

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