Advanced Materials | 自噬级联扩增纳米颗粒精确增强奥沙利铂诱导的癌症免疫治疗

化学免疫疗法可触发免疫原性细胞死亡（ICD），从而激活T细胞抗肿瘤免疫反应。据报道，某些化学疗法，例如奥沙利铂（OXA），可以通过诱导肿瘤细胞的免疫原性死亡来引发损伤相关分子模式的释放，从而刺激免疫细胞的肿瘤内浸润，进而杀死残留的肿瘤。但是，由于肿瘤的免疫原性低和在垂死细胞中肿瘤的内源性抗原呈递不足，对免疫反应的刺激较弱，限制了当前化学免疫治疗药物的临床效率。化疗药物引起肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡并激活免疫应答高度依赖自噬的参与，在垂死的细胞中，激活的自噬传递肿瘤细胞质成分进行溶酶体水解，从而促进内源性抗原的加工和对MHC II分子的呈递。除了抗原的加工和呈递外，自噬还可以促进垂死肿瘤细胞分泌ATP，可以作为DC前体的find me信号，并刺激细胞毒性T淋巴细胞浸润肿瘤。自噬的激活具有一个临界点，当自噬水平被轻度激活并低于临界点时，“轻度激活的自噬”通过清除受损的细胞成分并起到保护细胞的作用，帮助肿瘤细胞抵抗药物治疗，相反，当自噬水平被过度激活超过临界点时，过度激活的自噬会失去细胞保护功能，通过触发自噬细胞死亡途径导致细胞死亡。然而，化疗药物通常只刺激自噬到轻度激活阶段，而不是过度激活阶段，从而发挥肿瘤保护作用而不是死亡诱导作用。化疗药物试图诱导肿瘤免疫细胞死亡时，为了能够通过人为干预及时“过度激活”自噬，导致更多的肿瘤细胞自噬死亡，四川大学华西医学院Qin He课题组报道了一种自噬敏感纳米颗粒ASN的还原微环境和自噬水平双重响应的药物释放系统（图1a）。这篇文章于今年6月28日发表于Advanced Materials，题为：On‐Demand Autophagy Cascade Amplification Nanoparticles Precisely Enhanced Oxaliplatin‐Induced Cancer Immunotherapy。ASN是由自噬敏感胶束(称为C-TFG胶束)自组装而成，然后由OXA枝接透明质酸前药(HA-OXA)静电结合而成。C-TFG胶束作为ASN的核心，是通过基于自噬酶可裂解细胞穿透肽的两亲肽（C-TFG）单体自组装的，TFG序列上的可被自噬酶(ATG4)裂解的十三肽GTFGFRRRRRRRR被工程化为亲水性嵌段，胆固醇被设计为疏水尾部。肽胆固醇单体易于自组装成自噬敏感纳米颗粒(C‐TFG胶束)，当自噬被激活后，亲水性阳离子TFG肽很容易被ATG4酶裂解。自噬诱导药物STF-62247被封装到C-TFG胶束中，形成载有STF-62247的纳米颗粒，随后，将OXA共轭的透明质酸前药（HA‐OXA）静电结合到C‐TFG胶束的表面以形成ASN的外壳。到达肿瘤组织后，ASN的HA‐OXA前药外壳首先会被透明质酸酶剥离，在细胞内还原微环境下，结合的OXA将被还原为游离OXA，游离OXA可触发ICD，刺激自噬从静止状态进入轻度激活阶段，这可能有助于肿瘤细胞对抗OXA并保持肿瘤细胞存活。随后，暴露的C-TFG胶束在OXA诱导的自噬作用下立即分解，进一步实现强力自噬诱导剂STF-2247的按需释放。释放的STF-62247将进一步将“轻度激活”阶段转变为“过度激活”阶段，成功导致肿瘤细胞自噬死亡，并随后增强垂死细胞的肿瘤抗原呈递。相反，在自噬水平较低的肿瘤细胞中，ATG4酶是无活性的，因此G-TFG胶束可以在阳离子亲水肽的帮助下保持接触并在肿瘤细胞之间转移，直到找到另一个靶肿瘤细胞（图1b）。

图1. 通过免疫原性细胞死亡诱导和智能自噬增强作用的用于癌症免疫治疗的自噬响应纳米颗粒的示意图 作者通过MTT分析评估了ASN在CT26细胞中的细胞毒性，OXA / STF的IC50比单一OXA低2.83倍，这表明OXA / STF联合给药具有协同的细胞毒性（图2a），ASN的毒性比OXA / STF和OXA高得多，表明程序化药物释放系统具有优异的抗肿瘤功效。LC3是自噬最重要的相关蛋白，自噬激活时由LC3‐II/LC3‐I转化而来，因此，作者用LC3‐II/LC3‐I的比率来评估自噬水平，研究治疗过程中自噬是否能够被激活到过度激活水平。与PBS组相比，OXA处理可提高LC3-II / LC3-I比率，这表明OXA可以在一定程度上诱导自噬（图2b，c），ASN组在所有组中显示出最高的LC3-II / LC3-I比率，表明其最强的自噬诱导能力。此外，TEM法作为分析自噬水平的金标准，也被用来直接观察自噬体/自溶体的积累。如图2d所示，单个OXA仅诱导了一些自噬体/自溶酶体的积累，而OXA / STF和ASN组则表现出异常的自噬体/自溶酶体过度积累，强烈表明了自噬细胞死亡的发生。

图2. CT26细胞的细胞死亡途径 作者通过药物抑制策略研究了自噬死亡在细胞死亡途径中的确切比例，通过药物3-MA抑制早期自噬，消除自噬细胞死亡，结果表明OXA / STF和ASN的细胞毒性分别减轻了11.8％和15.0％，表明ASN的最佳细胞毒性部分源于其通过过度激活自噬诱导自噬死亡的能力（图2e）。 然后作者研究了CT26细胞中ASN对ICD的诱导能力，ICD的特征在于细胞外ATP的分泌，自噬已被证实参与ATP分泌过程（图3a）。作者通过CLSM进行mRFP‐GFP‐LC3报告蛋白监测细胞自噬过程，CLSM下的红色荧光点和黄色荧光点分别代表自溶酶体和自噬体，OXA / STF组和ASN组显着增强了红色和黄色的点状沉淀（图3b）。此外，作者发现ASN可以诱导CRT暴露和HMGB1释放（图4f-k），表明ASN可以诱导CT26细胞较强的免疫原性死亡。

图3. ASN诱导CT26细胞中最强的免疫原性细胞死亡 最后，作者评估了ASN在体内的免疫刺激作用，对移植CT26的Balb / C小鼠进行5次处理，然后分析免疫原性信号在肿瘤细胞上的暴露情况以及免疫细胞的募集情况。如图4所示，ASN组处理的肿瘤组织中未成熟DC的频率（图4a）、脾脏中成熟DC的频率（图4b）、治疗后肿瘤内浸润IFN-γ + CD4 + T细胞（图4c）、治疗后肿瘤内浸润IFN-γ + CD8 + T细胞（图4d）均表现出最高的水平，表明ASN可以产生更多的肿瘤抗原从而诱导DC成熟，同样，ASN也具有最高的肿瘤抗原呈递效率，招募更多的免疫细胞。免疫荧光法将LC3与CD4或CD8在肿瘤切片中共染色，ASN组的肿瘤切片表现出最强的自噬水平和最多的CD4 +细胞浸润（图4e）。免疫荧光结果的半定量分析表明，CD4 +细胞数量与LC3水平呈正相关（图4f），同样，免疫荧光结果（图4g）和相应的半定量数据（图4h）显示CD8 +细胞数量与LC3水平呈正相关，表明自噬水平越高，肿瘤组织中相应的T细胞浸润水平也随之提高。根据肿瘤的生长曲线（图4i-k），ASN表现出最为优秀的抗肿瘤功效。

图4. ASN增强了体内的免疫刺激和抗肿瘤效率总而言之，作者建立了自噬反应性“按需”药物释放系统ASN，该系统可以智能地响应肿瘤细胞的高还原微环境和自噬酶。到达肿瘤组织后，ASN的HA‐OXA外壳首先脱落并释放OXA，从而触发免疫原性细胞死亡，并同时从静止状态刺激自噬到保护细胞的“轻度激活”状态。然后，C-TFG胶束可以敏感地响应“轻度激活”自噬水平，并立即释放强大的自噬诱导剂STF-62247，这进一步将“轻度激活”阶段转变为“过度激活”阶段。及时的自噬级联扩增不仅导致更多的肿瘤细胞死亡，而且还参与了肿瘤内抗原的呈递和垂死细胞的免疫刺激分泌。结果，ASN在具有CT26肿瘤的小鼠中触发了最强的抗肿瘤免疫力，并表现出最佳的肿瘤抑制效率。内容提供：CGY

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