文献汇报-通过生物数据库分析预测肺腺癌预后标志物及抗癌免疫疗法的潜在靶标。

活动

汇报

第十三期肿瘤研究所文献分享汇报

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本次文献分享活动由朱恒舟博士为到场师生讲解题为“Smoker and non-smoker lung adenocarcinoma is characterized by distinct tumorimmune microenvironments”（肿瘤免疫微环境使得吸烟者和非吸烟者的肺腺癌具有不同特征）文献。

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背景：先前学者研究了肺癌患者免疫细胞与临床结局的关系以及吸烟对宿主免疫的影响。但是在吸烟和非吸烟因素下肿瘤免疫细胞对肺癌患者作用机制及预后的影响的报告并不明晰。鉴于近年来利用复杂组织的现有基因表达谱来估计肿瘤浸润的白细胞亚型，包括各种先天性和适应性免疫细胞，已发展出多种计算方法，本文就是利用最近发展的数据库CIBERSORT和改进的组织特异性标记基因矩阵，肿瘤和邻近正常组织的免疫细胞组成特征来了解吸烟和肿瘤免疫相互作用。

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朱博士首先介绍了吸烟会引起肺上皮细胞DNA损伤和免疫功能障碍，导致肺癌的发生和发展。

文章通过对11个肺癌基因表达数据集进行了综合分析，发现长期吸烟者和不吸烟者肺癌发生的途径不同。对肺腺癌中21种免疫细胞的组成模式进行了分析，两组免疫细胞，肥大细胞和CD4+记忆T细胞，它们与休息和激活状态的结果完全相反。肥大细胞和CD4+记忆T细胞从静止状态向活化状态的转变可能是肿瘤发生发展过程中吸烟诱导的重要过程。肥大细胞和CD4+记忆T细胞的异常活化在吸烟诱导的肺免疫功能障碍中导致肿瘤的发生起着重要作用。这些发现为调节肿瘤免疫，预防肺癌患者肿瘤的侵袭和转移提供了治疗机会。

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其次梳理了文献采用的方法和重要发现。

(1)样品收集和数据处理：GEO GLP570: GSE10245 (n=40),GSE19188 (n=110), GSE30219 (n=83), GSE31210 (n=224), GSE37745(n=91),andGSE50081 (n= 128),GLP96:GSE10072(n=107), SE14814 (n=71), GSE31547 (n = 50), GSE68465 (n = 353), and GSE7670 (n = 54)

数据来源

(2)基因表达谱及信号通路富集。

GSE19188,GSE10072, GSE31547, GSE7670 用于区分肿瘤组织及正常组织, GSE30219,GSE31210, GSE50081, GSE10072, GSE31547, GSE68465 用于吸烟以及不吸烟差异分析。

两组差异基因取交集，将吸烟患者的中上调的基因归为不良组，将不吸烟患者中上调的基因归为有利组。利用IPA通路富集。

基因表达、通路富集

肺腺癌基因异常及其相关通路的改变。

左图是四个数据集中失调基因的热图。肿瘤组织与正常组织间存在明显的基因表达模式。右图是四组数据集中失调基因的通路富集分析。在这四个数据集中，有3100个基因在肿瘤和正常样本之间有一致的差异表达。其中肿瘤基因上调1720个，下调1380个，分别占4个数据集中共有基因的16.73%和11.42%。为了表征这些失调基因的功能，分别对上调和下调的基因组进行了通路富集。上调基因富集的通路大多参与细胞周期调控、细胞应激和损伤功能，下调基因富集的通路则与细胞免疫反应功能有关。

总之，这些结果显示了肿瘤组织中信号通路的异常表达，肿瘤和正常组织之间可能存在不同的炎症反应模式

(3)生存分析：

通过生存分析发现吸烟引起免疫功能障碍，影响临床疗效。

生存分析

考虑了患者的年龄、性别和突变状态后，从不吸烟者比吸烟者无复发生存率、患者总体生存率更高。

左图中吸烟者肿瘤样本中富含基因的通路显着下调(左)和上调(右)。

右图肿瘤-正常组织比较中，在从不吸烟(左)和吸烟(右)者观察到通路都发生了富集。

在吸烟患者中检测到1298个基因上调，977个基因下调。通路富集观察到，大多数富集途径与细胞周期调控、增殖和发育类别有关。

从不吸烟者中IL-3信号和吞噬体形成途径参与细胞免疫反应特别丰富。

结果提示，不同吸烟状态下肺癌发生分化模式所涉及的分子通路不同，吸烟对肿瘤信号通路和肿瘤微环境的改变具有显着的影响。

（4）使用1. CIBERSORT（是一个有价值的方法来研究肿瘤浸润，其中包括成千上万的病人历史数据集。） 2. xCell数据库从基因表达谱推断免疫细胞浸润。

（5）构建肺腺癌特征性基因表达矩阵及免疫细胞分布情况。先做好以下工作1..Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)去除与肺腺癌相比高表达的基因2. Robust Multiarray Averaging (RMA)归化3. CIBERSROT模拟表达谱。

由此方法找出吸烟者和不吸烟者肿瘤免疫细胞的成分差异

基因矩阵估计基因表达谱中免疫细胞组分

由于免疫系统极其复杂，包含各种先天免疫细胞和适应性免疫细胞。改进的标记基因矩阵显示了推断复杂组织免疫细胞组成的需要高稳定性和可靠性。

(A)图中在1000个模拟中热图显示了每种免疫细胞的准确性，barplot显示了模拟中每种细胞亚型的中位数准确性，模拟结果表明，对21种白细胞类型的预测具有极高的准确性，这表明作者改进的特征基因矩阵有效性(B)是平均肿瘤免疫细胞组成估测，并由CIBERSORT横跨11个数据集。

结果证实这些数据集具有相似的肿瘤免疫细胞浸润水平，表明这些微阵列研究中组织收集、处理和存储的一致性。

肿瘤组织与正常组织免疫细胞分布情况

使用CIBERSROT估计肿瘤和邻近正常组织的绝对免疫浸润评分。在不同的数据集中，正常组织的免疫细胞含量明显高于肿瘤组织

免疫细胞组分与生存结果之间的关系。

肿瘤和正常样本之间免疫细胞的成分差异(左图)以及肿瘤免疫细胞组分与存活率的关系(右图)。

鉴定了14种免疫细胞亚型，它们在肿瘤标本和正常标本之间具有显着的差异，5种免疫细胞与患者生存显着相关，它们是静息肥大细胞、M0巨噬细胞、活化肥大细胞、活化CD4+记忆T细胞。也句话说，与邻近正常组织相比，肿瘤中处于下调状态的静息肥大细胞预示着良好的预后，而巨噬细胞M0、活化肥大细胞和CD4+记忆T细胞则预示着不良的预后。

吸烟者与非吸烟者的免疫细胞分布情况

该图显示吸烟和不吸烟的肿瘤患者免疫细胞的成分差异(左)以及肿瘤免疫细胞组分与存活率的关系(右)。

在吸烟和不吸烟患者的人噬细胞M0、活化肥大细胞和CD4+记忆T细胞存在成分差异。

更重要的是,吸烟的患者中肥大细胞和CD4 +记忆 T细胞比不吸烟的患者比例要低，是有利的生存结果的重要预测因子。

吸烟者中活化的肥大细胞和激活的CD4+记忆T细胞比不吸烟者有更高的分化，而且是不良生存结果的重要预测因子。

6 线性回归分析

为了进一步探讨不同吸烟状态下肿瘤免疫浸润的异质性，对肿瘤浸润白细胞的比例与其相关趋化因子的表达进行了线性回归分析。分析发现吸烟者的趋化因子/受体网络被选择性地改变。

绿色的节点是趋化因子配体，红色的节点是相应的趋化因子受体; 线表示趋化因子与其受体之间存在的分子相互作用。

该图显示在吸烟条件下某些趋化因子被选择性地改变来应对烟雾刺激，随后导致肿瘤微环境中肥大细胞和CD4+ memoryT细胞的激活。

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最后朱博士为大家总结了本篇文献贡献：

描述了不同组织类型和吸烟状态下肺腺癌中免疫细胞的组成模式，并揭示了免疫组成与临床结果之间的复杂关联。

当静止和活化的肥大细胞结合在一起时，它们与非小细胞肺癌患者的延长生存期显着相关。而吸烟使肥大细胞、CD4 +记忆T细胞中从静息状态转变为活化状态，引起的肺部免疫功能障碍，随后促使肿瘤的发展和进展。

发现肥大细胞和CD4+记忆T细胞水平与大量ccl5相关的趋化因子受体显着相关，这种关联在吸烟的人身上更为明显。而CCL5-CCR5轴作为一种生长因子，刺激血管生成，参与免疫逃避机制在肿瘤的发生发展中发挥着积极的作用。此文分析中，吸烟和非吸烟状态下CXCL11-CX3CR1轴表现不同，这与肿瘤的血管生成和转移可能有关，因此可以推断吸烟影响某些趋化因子的表达，从而激活CD4+记忆T细胞，促进肿瘤的发生发展。

这些发现指明了免疫子集可以作为预后生物标志物，或抗癌免疫疗法的潜在靶标的方向。

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通过朱博士分享的文献是使到场师生学习到如何利用生物信息技术结合细胞免疫学从而更好地服务于实验设计，总之此次文献分享活动大家收获颇丰！

撰写：谢辉

审阅：周红光

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