编者按：
蛋白质组作为后基因组学的生力军，将基因组变化引起的功能改变与功能实际执行者蛋白质联系起来，可以获得独特的生物学见解，基因组、转录组、蛋白质组、磷酸化蛋白质组多组学分析已成功针对多种癌症进行了分子分型，例如乳腺癌[1,2]、卵巢癌[3]、肝癌[4,5,6]、胃癌[7,8]、前列腺癌[9,10]、结肠和直肠癌[11]……
肾细胞癌是世界十大常见的癌症之一，其中75%肾细胞癌死亡病例为透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)。为了揭示 ccRCC 发生的分子机制， TCGA 已经通过基因组、表观基因组、转录组测序技术，鉴定出了多种包括 VHL 基因异常失调在内的 ccRCC 靶标。这些研究证明了分子表征的价值，但是对于临床治疗仍缺乏一定的指导意义。目前，手术切除是 ccRCC 局部肿瘤的主要治疗手段，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的靶向药物对于 ccRCC 患者而言效果有限。这些结果说明了肿瘤发生过程的复杂性，并提示仅基因组、表观基因组和转录组分析可能不足以充分分辨这种癌症类型，以提供有效的治疗方法。
10月31日，又一篇重磅级多组学癌症分子分型文章于 CELL 发表，“Integrated Proteogenomic Characterization of Clear Cell Renal Cell Carcinoma”，研究者通过对未治疗的 ccRCC 和配对的癌旁组织样本（NAT）进行了基因组、表观基因组、转录组、蛋白质组、磷酸化蛋白质组学的整合分析，基因组分析鉴定出一个与基因组不稳定性相关的独特分子亚群；蛋白质与基因组学多组学关联分析鉴定出由基因组改变所导致的蛋白质失调，包括氧化磷酸化相关的代谢、蛋白质翻译过程和磷酸化信号调控等通路；对肿瘤中免疫细胞浸润程度进行分析，描绘了四种以不同细胞通路为特征的免疫性 ccRCC 亚型。为基于 ccRCC 病理生物学的合理治疗选择提供了理论指导。
研究结果
1. 蛋白质组、磷酸化蛋白质组、基因组、转录组数据对110个未接受过治疗的 RCC 和84个配对匹配的 NAT 样品进行蛋白质组与磷酸化蛋白质组检测，鉴定出11,355个蛋白和42,889个磷酸化肽段，其中7,150个蛋白和20,976个磷酸化肽段在所有样品中都检测到。结合病理学特征与前期 TCGA 发现的 RCC 分子特征进行质控，最终确定103个 ccRCC 和80个 NAT 组织样品的数据，用于后续全面的蛋白质组学分析。对所有110个肿瘤样品进行了全基因组测序（WGS），全外显子组测序（WES）和 RNA 测序（RNA-seq），其中107个进行 DNA 甲基化分析，同时75个 NAT 样本进行 RNA 测序。2. ccRCC 队列的基因组全景分析
利用基因组水平数据进行染色体插入缺失分析、染色体重排的频率和类型分析、体细胞突变分析、启动子 CpG 岛的甲基化分析发现：①3p 染色体的臂级丢失是最常见的事件（93％）（图1A）；②61％的 ccRCC 病例表现出一个或多个易位事件，主要涉及3p 染色体位点（图1B）；③VHL 基因失调是最常见的变化，可以在85％的肿瘤中观察到（图1C）；④ 根据之前报道的 CpG 岛甲基化表型标志物（CIMP）进行分类，36例 CIMP+（阳性）肿瘤显示出级别更高、阶段更晚、基因组不稳定性更高等特征。
图1 基因组改变及其与 mRNA，蛋白质和磷酸蛋白丰度的关系
3. 基因组与蛋白质组关联分析
通过整合多组学数据，研究者筛选出对转录水平、翻译水平和翻译后水平都有影响的基因（图2A），作为肿瘤诊断以及肿瘤等级划分的潜在基因靶标。包括SQSTM1（5q35.3）、OSBPL3（7p15.3）、GOLPH3（5q13.3）和YY1（14q32.2）。对这些基因组变化进行功能通路分析（图2B），3p 染色体的丢失与缺氧信号的上调，细胞周期调节和糖酵解，氧化磷酸化（OXPHOS）的下调，脂肪酸代谢和 TCA 周期有关；5q、 7p、9p、14q 功能见图2B。
图2 拷贝数变异（CNV）对蛋白质丰度的影响
4. ccRCC 与 NAT 的蛋白质组学变化分析
主成分分析（PCA）可以清楚地区分 ccRCC（n = 103）和 NAT 样本（n = 80）（图3A）。总共筛选到820种差异表达蛋白（log2倍数变化> 1， p <0.05），相对于 NAT，在 ccRCC 肿瘤中有565种蛋白质下调，255种蛋白质上调。富集分析显示：肿瘤中免疫应答、上皮间充质转化（EMT）和多种信号通路（缺氧，糖酵解和 mTOR）上调；而 TCA 周期、脂肪酸代谢和氧化磷酸化（OXPHOS）下调（p <0.05；图3B）。
以往研究证明 ccRCC 肿瘤为代谢疾病，研究者遂针对细胞代谢通路进一步细致分析（图3C）。在此分析中，糖酵解途径中的蛋白质及其同源 mRNA 均上调，而与 OXPHOS 相关的蛋白质则下调且与 OXPHOS mRNA 表达不一致（图3C–3E），表明 OXPHOS 的调控发生在翻译水平。
图3ccRCC 肿瘤与 NAT 的转录组和蛋白质组学差异表达
5. 磷酸化蛋白质组学分析
肿瘤与 NAT 配对组织之间的差异磷酸化肽段分析确定 CDK1 和 MAPK1（ERK2）是大多数肿瘤中两个排序最高的磷酸-底物事件（图4A）。CDK1 与有丝分裂过程中基因组保真度有关；MAPK1 信号通路全面分析表明，几乎在所有肿瘤中，上游受体酪氨酸激酶表皮生长因子受体（EGFR）的蛋白质和磷酸化肽段表达增加，而血管内皮生长因子（VEGF）受体在肿瘤中选择性的表达和磷酸化（图4A）。利用所有肿瘤样本中差异磷酸化肽段数据，研究者构建了几个独立于蛋白质组学和转录组学的磷酸化肽段共表达网络，包括细胞周期和血管生成（图4C，4D）。磷酸化蛋白质组学分析确定了在肿瘤中激活的多种信号转导途径，为扩大治疗选择范围提供了证据，超出了目前 FDA 批准的针对 VEGF 和 mTOR 的疗法（图4B），靶向 mTOR 和 MAPK / ERK 途径的联合治疗可能是一种更有效的方法。
图4磷酸底物与其相关激酶和肿瘤的磷酸共表达网络
6. ccRCC 中的免疫浸润分析
研究者基于免疫浸润、转录组学、蛋白质组学特征，将 ccRCC 队列分为四个亚型：①CD8+炎性；②CD8-炎性；③VEGF 免疫缺乏；④代谢性免疫缺乏。CD8+炎性型肿瘤：免疫浸润程度最高，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4（免疫逃避标记物）等基因表达上调，14号染色体缺失频率较高；CD8-炎性型肿瘤：具有天然免疫反应特征，肿瘤微环境（TME）中树突状细胞和巨噬细胞较多，补体和凝血级联蛋白表达也有所增加（图5A，5B）；VEGF 免疫缺乏型肿瘤：SUMOylation（蛋白水平）和 Wnt / b-catenin、RAP1 和 Notch 信号通路（mRNA 水平）高表达；代谢性免疫缺乏型肿瘤显示出较低的免疫、基质和微环境评分， mTOR、线粒体、OXPHOS、糖酵解等通路功能增强。VEGF 免疫缺乏型肿瘤与患者生存期改善相关，而 CD8 +炎症型肿瘤与患者预后不良相关。
图5ccRCC 肿瘤分子分型
7. ccRCC 肿瘤分级
基于蛋白质组数据将 ccRCC 队列分为三组（ccRCC1-3），它们被七个主要的蛋白质 clusters 区分（图6）。ccRCC2 与先天免疫和血小板脱颗粒有关，ccRCC3 与糖酵解、mTOR 信号传导和缺氧相关的蛋白表达增加相关。ccRCC2 和 ccRCC3 与较低的肿瘤分级相关（分别为p <0.01和p <0.02）， ccRCC1 与较高的肿瘤分级相关（p <0.001和p <0.01），其特征是适应性免疫应答升高，N-糖基化修饰、OXPHOS 蛋白表达和脂肪酸代谢升高。
图6应用蛋白质组数据对 ccRCC 肿瘤分级
小编总结
总体来说，这项研究运用基因组、表观基因组、转录组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学检测方法对 ccRCC 肿瘤和相应的NAT进行数据整合，将 ccRCC 肿瘤分为四个亚型，为深入研究 ccRCC 肿瘤发生提供了宝贵的生物信息资源。表明只有将互补的蛋白质组学和基因组分析结合起来，才能将基因变化与蛋白质功能改变联系起来，进而获得独特的生物学见解。
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