【文献解读】文献158：胃食管腺癌循环肿瘤DNA测序分析

Circulating Tumor DNA Sequencing Analysis of Gastroesophageal Adenocarcinoma

Clinical Cancer Research

背景

胃食管腺癌(GEA)是一个重要的全球健康问题，预后差，且靶向药物的研究也因基因组变异频率低和异质性的问题而受到限制。

常规组织DNA测序可以在至少38%的胃食管腺癌患者中检出受体酪氨酸激酶（RTK）如HER2、EGFR、MET、FGFR2基因的扩增，而只有47%的HER2扩增的患者使用曲妥珠单抗后获益。在之前的研究中已通过原发灶和转移灶组织DNA测序比较了异质性，且在一个小队列的“三配对”样本（即原发灶-转移灶-ctDNA）中进行了测序比较，其中转移灶和ctDNA检测结果在87.5%的样本中一致，提示ctDNA无创检测可能更有效地指导转移性疾病的靶向治疗选择。使用组织DNA测序观察胃食管腺癌早期或晚期的基因组变异分布情况也已有报道。然而，这些研究依赖于一个时间点的单一突变检测，不能解释空间和时间的异质性。

本研究转向ctDNA-NGS结合组织NGS以获得一个全面和更完整的胃食管腺癌基因组变异频谱及其异质性，以了解其对靶向治疗的意义。

实验设计

本研究对大量人群(n=2140次试验；1630例患者)的ctDNA-NGS结果进行评估（包括369份临床信息明确的患者，即“临床注释队列”）。评估患者基因组变异(GA)频谱和临床病理特征与结果的相关性。

结果

结果-1纳入测序分析的患者临床病例特征

全球队列共包含1630例患者，共进行了2140次ctDNA-NGS检测，患者中位年龄为63岁，71%为男性。原发性解剖肿瘤定位为胃的占53%，食管/胃食管交界处的占47%。

“临床注释”队列（N=369例，698项测试）包括273例来自美国芝加哥大学(UC)的患者和96例来自三星医疗中心(SMC)的患者。UC队列和SMA队列比较发现，UC患者年龄较大（中位年龄62 vs 57.5岁，P= 0.003），且以食管/胃食管交界处肿瘤为主（67% vs. 0%, P < 2.2*10-6）。

结果-2ctDNA检测

血浆中最大肿瘤体细胞突变等位基因频率(maxVAF)反映了ctDNA在所有cfDNA中所检测到的最大变异克隆，可作为评估ctDNA含量的指标。从未经治疗的IV期患者(n =144)中获得样本（“基线队列”）来进行ctDNA预测和预后生物标志物的评估。

a. 使用基线队列，评估了maxVAF作为疾病数量/负荷的替代标记，并确认了所涉及的疾病病灶数量与maxVAF之间的直接相关性（图A）。

b. 原发肿瘤完整患者的平均maxVAF较原发肿瘤切除者高（10.9% vs 6.5%，P=0.09）（图B）。肝脏侵犯患者（n=39/144）的平均maxVAF较高（19.2% vs 6.2%，P =0.001）；肺部侵犯患者（n=19/144）的平均maxVAF较高（23.3% vs 7.6%，P =0.01）（图C）。相反地，患有“仅腹膜性”疾病(n=35/144)的患者的平均maxVAF为2.5%，而“非仅腹膜性”疾病患者为11.9%(P=5.1e-6)（图D）。

疾病部位和负荷都强烈影响肿瘤DNA脱落和随后的ctDNA-NGS敏感性。

结果-3maxVAF的临床应用

临床ctDNA-NGS通常是为了检测基因组变异而进行的，但ctDNA进入血液循环的数量可能成为早期或晚期疾病的预后标志物。将可检测到ctDNA定义为maxVAF≥0.25%，并将不同队列的检测结果与生存率进行比较分析。

a. 在治疗/手术前队列中，检测到ctDNA的患者（17/29）的中位无病生存期（mDFS）为15.2个月，比未达到检测水平患者低，但无显著差异(P=0.1）（图A）。

b. 在根治性切除术后提取的样本中可检测到的ctDNA的患者（n=7/22）的mDFS显著降低为12.5个月（P=0.03）（图B）。

c. 在典型病例中，连续多次检测ctDNA有助于预测非复发性和复发性疾病（图C-D）。由于观察到maxVAF与疾病的负荷相关，推测在晚期情况下，较高的maxVAF预示着更差的预后。

d. 在基线队列中，maxVAF小于平均值（即9.7%）的患者(n=104)的mOS为14.8个月，高于平均值的患者(n=40)为9.4个月(P=0.1)（图E）。对IV期确诊后进行一线治疗的患者在150天内进行连续的ctDNA-NGS监测，maxVAF降低超过50%的患者中位存活时间为13.7个月，降低不超过50%的患者为8.6个月（P =0.02）（图F）。

maxVAF动力学表明ctDNA-NGS可以作为早期预后的生物标记物，并评估“无反应者”早期改变治疗的可能性，类似PET指导治疗。

结果-4胃食管腺癌的基因组变异频谱

对全球队列的2140次测序结果进行分析总结，平均每次测试检出3个基因组变异。相比远端胃癌肿瘤，基因组变异更常见于近端原发性食管/胃食管交界处肿瘤(85%vs 79%，P=0.0009)。

在全球队列中，经常出现基因组变异的有TP53(53%)、HER2(17%)、EGFR(17%)、KRAS(15%)、MYC(13%)、PIK3CA(13%)和MET(11%)（图A）。基因组变异被进一步划分为非同义突变(图B)和扩增(图C)，TP53、ARID1A、APC和SMAD4基因中通常发生突变，而MYC、HER2、KRAS、EGFR，MET和FGFR2则常发生扩增。

比较UC和SMC队列的频谱，以评估东西方患者的突变差异。在UC队列中观察到更频繁的ARID1A突变和KRAS、EGFR和PIK3CA扩增；比较UC和SMC队列的胃癌患者(不包括食管/胃食管交界处肿瘤)发现，在UC队列中，ARID1A和KRAS突变发生率更高，而PIK3CA突变在SMC队列中更常见（图A-C）。

通过比较TCGA队列（代表早期原发性肿瘤组织-NGS）、MSK队列（代表新诊断的IV期患者组织-NGS）以及本研究的队列（代表晚期疾病ctDNA-NGS），评估早期和晚期疾病之间及组织NGS与ctDNA-NGS检测之间是否存在显著的基因组变异差异。TP53突变在MSK和TCGA患者中更为常见(P=8.4*10-15)。在TCGA队列中，MYC(P=2*10-6)、CDK6(P=0.003)和CCNE1(P =0.0006)的扩增更常见（图D）。这三个队列的差异可能反映了样本采集时间、患者内部异质性和肿瘤脱落限制等情况。值得注意的是，在全球队列中，可靶向的基因组变异的发生率普遍高于组织NGS，尤其是RTK扩增(例如MET、FGFR2和EGFR)。

结果-5胃食管腺癌中广泛的时空分子异质性

34例新诊断未治疗的IV期GEA患者分别接受了ctDNA-NGS和组织-NGS（包括原发灶和转移灶）检测。当panel限制为ctDNA和组织中存在的72个基因时，在原发肿瘤、转移肿瘤和ctDNA中分别有57%、58%和62%的患者中检出了基因组变异。然而，在鉴定的183个特征基因组变异中，只有48(26%)个基因组变异在3种样本中均检出（图A）。图C显示结合组织-NGS和ctDNA-NGS可提高检测HER2、EGFR、FGFR2和MET基因组变异的敏感性。

除了基线的空间分子异质性外，ctDNA-NGS还可以检测到一段时间内获得的抗性(时间异质性)。在一线抗HER2治疗失败后，使用配对的治疗前后组织和血浆样本检测持续性HER2扩增的发生率与转化为HER2非扩增状态的发生率。在疾病进展过程中，15例患者中只有4例(27%)经ctDNA-NGS分析显示持续扩增HER2（图D）。1例患者组织NGS显示HER2扩增，但未检出HER2 ctDNA扩增，这可能是由于低肿瘤脱落。经ctDNA-NGS和/或组织检出持续扩增患者治疗后的ctDNA-NGS检出KRAS(G12D和T35A)、NF1(N1503S)和PIK3CA(E542K)等获得性突变以及BRAF、KRAS、PIK3CA和FGFR1的共扩增，可能是抗性的机制（图E）。

结果-6ctDNA-NGS在预后和/或预测生物标志物中的作用

对基线队列(n=144)再次分析了关键基因(PIK3CA、BRAF、KRAS、HER2、FGFR2、MET和EGFR)在胃食管腺癌中的预后和预测意义。

PIK3CA突变患者的生存时间较短（3.8 vs13.6个月，P=0.006）(图5A)。同样，BRAF基因组变异患者的生存期较野生型短（5.6 vs 13.7个月，P=0.02）（图5B)。

对86例可在任何时间点同时具有ctDNA和组织-NGS的“基线” IV期患者分析，86例中有21例（24.4％）具有HER2扩增，但只有13例（15.1％）在组织、ctDNA中均检出扩增，3例被认为是临床HER2阳性，但缺乏组织或ctDNA-NGS的扩增（图C）。23例接受HER2抑制剂一线治疗。在有或没有ctDNA-NGS HER2扩增的患者中，存活率没有显著差异（12.7 vs 8.7个月，p=0.4）(图D)，但通过maxVAF调整血浆拷贝数后，ctDNA检出HER2扩增患者的mOS明显改善（15.9 vs 9.4个月，P=0.07）(图E)。将组织或ctDNA检出扩增的队列与未扩增队列相比，mOS显著提高（26.3 vs 7.4个月，p=0.004）(图F)。

将评估放在EGFR扩增的ctDNA-NGS检出与预后的关系上，未治疗患者中EGFR扩增组与未扩增组的生存率无明显差异（14.4 vs 13.3个月；P =0.6）（图G）。在基线队列中，144例患者中有22例使用ctDNA-NGS检出了EGFR扩增，另有5例使用组织-NGS检出扩增。其中14例接受了EGFR靶向治疗。在EGFR扩增的患者中，接受EGFR靶向治疗的患者的mOS较长（21.1 vs 14.4个月，P=0.01）（图H）。当血浆拷贝数调整后，ctDNA检出扩增或基于组织的扩增患者的mOS更长（21.1 vs 6.2个月，P=0.001）（图I）。

结论与讨论

本研究对ctDNA-NGS的效用进行了综合分析，对1630例胃食管腺癌患者进行了2140次单独测试，并提供了大量的子集(来自369例患者的698项测试)，对具有明确临床信息的患者的测试结果进行详细的临床病理和结果分析。

通过全球队列，首先建立了对ctDNA-NGS检测的认识，并确定治疗史，肿瘤部位，和疾病负荷决定了肿瘤DNA的脱落和随后产生的ctDNA-NGSmaxVAF。

确定了根治性切除后残留的ctDNA检测可靠地预示了早期疾病的最终复发和较差的预后。这与其他类型肿瘤的报道一致，并提示GEA术后ctDNA检测可能是前瞻性辅助治疗研究中的重要因素。

根据ctDNA-NGS确定的GEA中基因组变异的分布情况证明在初诊时绝大部分GEA患者（即使在早期阶段）也具有可识别的基因组变异，特别是在排除仅患有腹膜疾病和近期接受过治疗的患者之后。在比较“西部” UC和“东部” SMC队列之间的基因组变异差异时，观察到基因组变异发生率相似但存在一些差异。这些差异包括在UC子集中KRAS和ARID1A基因组变异的发生率更高，而SMC队列则富含PIK3CA变异，这与先前的文献一致。

患者之间和患者内部的分子异质性已成为在GEA中成功实施靶向疗法的巨大障碍。本研究评估了迄今为止报道的最大的GEA“三配对样本”队列，并再次发现了显著差异，包括常规已知且可能靶向的RTK变异，例如HER2，EGFR，MET和FGFR2。将组织-NGS和ctDNA-NGS结果合并分析，最有可能从抗HER2和其他靶向疗法中受益。结合ctDNA-NGS可能是一种在基线和长期内克服公认的分子异质性的策略。

临床ctDNA-NGS检测在早期疾病MRD的检测和作为一系列肿瘤标志物方面都具有应用前景。ctDNA-NGS与组织-NGS联合使用，可能是一种最佳确定可靶向的基因组变异和耐药机制的方法，以克服患者内部的异质性。

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